V procesu izvajanja genetskih študij se pogosto srečujemo z nezadostnimi vzorci RNK, na primer za preučevanje drobnih anatomskih oralnih tumorjev, celo enoceličnih vzorcev in vzorcev specifičnih genskih mutacij, ki se v človeških celicah prepisujejo na zelo nizkih ravneh.Seveda bo za test COVID-19, če brisi niso na pravem mestu ali premalokrat med vzorčenjem, velikost vzorca zelo majhna, zato je Komisija za zdravje in načrtovanje družine nastopila pred dvema dnevoma in opravil test, in če vzorčevalnik nukleinskih kislin ni odvzel šestih vzorcev, lahko to prijavite.
Občutljivost reagenta je pomembna, ker imamo to ali ono težavo, kaj lahko torej storimo, da izboljšamo občutljivost RT-PCR?
Preden razpravljamo o možnih rešitvah, omenimo dva velika zapleta s situacijo, ki smo jo pravkar omenili.
Najprej nas skrbi izguba RNA, ko imamo v vzorcu le nekaj celičnih populacij.Če se uporabljajo tradicionalne metode ločevanja in čiščenja, kot sta kolonska metoda ali metoda precipitacije nukleinske kisline, obstaja velika možnost, da se nekaj vzorcev izgubi.Ena rešitev je, da dodamo nosilno molekulo, kot je tRNA, vendar tudi takrat ni zagotovila, da je naš obnovitveni poskus v redu.
Kaj je torej boljši način?Dobra možnost za gojene celice ali mikroanatomske vzorce je uporaba neposredne lize.
Ideja je, da celice razdelimo za 5 minut, sprostimo RNA v raztopino, nato zaustavimo reakcijo za 2 minuti, nato dodamo lizat neposredno v reakcijo povratne transkripcije, tako da se nobena RNA ne izgubi, in na koncu damo nastalo cDNA neposredno v reakcijo v realnem času.
Toda kaj, če lahko zaradi omejenega izhodišča ali majhne količine izražanja ciljnega gena recikliramo vso RNK in še vedno ne zagotovimo dovolj predlog za dober signal v realnem času?
V tem primeru je korak predojačenja lahko zelo koristen.
Sledi shema za povečanje občutljivosti po obratni transkripciji.Preden začnemo, se moramo na nižji stopnji vprašati, katere tarče nas zanimajo, da lahko oblikujemo specifične primerje za te tarče za predhodno ojačanje.
To je mogoče doseči z ustvarjanjem mešanega primerja z do 100 pari primerjev in 10- do 14-kratnim reakcijskim ciklom.Zato je za predhodno pomnoževanje dobljene cDNA potrebna glavna mešanica, posebej zasnovana za to zahtevo.
Razlog za nastavitev števila ciklov med 10 in 14 je, da to omejeno število ciklov zagotavlja naključnost med različnimi tarčami, kar je ključnega pomena za raziskovalce, ki potrebujejo kvantitativne molekularne informacije.
Po predpomnoževanju lahko pridobimo veliko količino cDNA, tako da je občutljivost zaznavanja na zadnji strani močno izboljšana, vzorec pa lahko celo razredčimo in izvedemo več reakcij PCR v realnem času, da odpravimo morebitne naključne napake.
Čas objave: 11. aprila 2023